Se estudió de manera prospectiva a 66 pacientes con FQ (34 varones y 32 mujeres), con una edad media ± desviación estándar de 16,2 ± 8,3 años (rango: 3-36). En todos ellos el diagnóstico se estableció por un test del sudor con valores de cloro superiores a 60mEq/l en 2 determinaciones y clínica indicativa del diagnóstico13. La media de su capacidad vital forzada (FVC) en porcentaje del valor teórico fue del 79,85 ± 26,24%, y la del volumen espiratorio forzado en el primer segundo (FEV1) fue del 72,09 ± 31,28%. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del hospital. Se informó a todos los pacientes de las características del estudio, pero no se requirió consentimiento firmado porque no se modificó la práctica clínica habitual de la Unidad de FQ.

Se evaluó prospectivamente a los pacientes durante sus visitas de control a la consulta de la Unidad de FQ (cada 3 o 4 meses) a lo largo de un período de entre 2 y 6 años. En cada consulta, además de la exploración física general, se realizó una exploración selectiva de la cavidad bucal con el fin de evaluar si había en ésta colonización por C. albicans. A los pacientes con C. albicans en la cavidad bucal se les trató con un antifúngico tópico y se retiraron temporalmente del estudio hasta su erradicación. Se realizaron consultas y estudios adicionales cuando los clínicos responsables lo consideraron necesario. Se efectuó un estudio anual que incluía radiografía de tórax (evaluada con el sistema de puntuación de Brasfield siempre por el mismo neumólogo)14 y espirometría. Todas las secreciones respiratorias se cultivaron para hongos durante los 6 años del estudio. Durante los últimos 4 años del estudio se analizó en cada paciente al menos una muestra de suero cada 8 meses. Tras una primera fase del estudio, ya mencionada, el suero restante se congeló a –20°C para su procesamiento posterior en una segunda fase del estudio. En esta segunda fase se analizaron las respuestas humorales IgG, IgA e IgM frente a A. fumigatus y C. albicans sólo en los pacientes que tenían al menos 4 muestras de secreciones respiratorias analizadas en el último año del estudio (n = 66). Como grupo control se utilizaron los sueros de 15 individuos sanos, no atópicos ni fumadores, de similar edad y sexo que la población de estudio.

Se definieron varios grupos de acuerdo con los resultados microbiológicos: pacientes que tuvieron al menos un cultivo positivo para A. fumigatus o C. albicans en las secreciones respiratorias durante todo el tiempo que duró el estudio (pacientes con A. fumigatus o pacientes con C. albicans, respectivamente), y pacientes que nunca tuvieron A. fumigatus o C. albicans en las secreciones respiratorias durante el estudio (pacientes sin A. fumigatus o pacientes sin C. albicans, respectivamente).

Las muestras respiratorias (esputos o aspirados orofaríngeos en los menores de 2 años o en los pacientes con dificultad para expectorar) se recogieron con una frecuencia variable, habitualmente una en cada consulta, con un máximo de una al mes. Las muestras se trataron con N-acetilcisteína durante un tiempo no superior a 30min para lograr su fluidificación. A continuación se realizaron siembras por duplicado, en medio de Sabouraud-cloranfenicol y de Sabouraud-cloranfenicol-actidiona a 2 temperaturas, una a 30 oC y otra a 37 oC, durante 4 semanas, con revisión diaria y lectura semanal.

Se efectuó espirometría a 60 pacientes mayores de 5 años que fueron capaces de realizarla. La FVC y el FEV1 se midieron sin broncodilatación con un espirómetro VMax 20 (SensorMedics Corporation, Yorba Linda, California, EE.UU.) según las recomendaciones de la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica15. Los resultados se expresaron como porcentaje de los valores teóricos de acuerdo con la edad, sexo, peso, estatura y raza basados en los teóricos de la Comunidad Económica del Carbón y el Acero16. Para su análisis estadístico se han utilizado los valores medios obtenidos por cada paciente a lo largo del estudio.

El sistema de puntuación de Brasfield valora 5 aspectos radiológicos: atrapamiento aéreo, sombras lineales, lesiones noduloquísticas, consolidaciones segmentarias o lobulares y una impresión general de la gravedad. En el caso del atrapamiento aéreo, las marcas lineales y las lesiones noduloquísticas, la puntuación 0 significa ausente, y se puntúa de 1 a 4 según la gravedad. En las lesiones mayores, la puntuación 0 indica ausente y se puntúa de 3 a 5 según la gravedad. En cuanto a la gravedad general, 0 significa ausente y se puntúa de 1 a 5 según la gravedad. La puntuación total se obtiene restando la suma de todo lo anterior de 25. Por tanto, a mayor puntuación, mejor estado radiológico, de modo que 25 indica una radiografía de tórax sin alteraciones. Para su análisis estadístico se han utilizado los valores medios obtenidos por cada paciente a lo largo del estudio.

Los resultados de IgG, IgA e IgM específicas frente a A. fumigatus y C. albicans se determinaron por métodos de enzimoinmunoanálisis. Para A. fumigatus, cada pocillo de la microplaca (Costar 3590 Corp., Cambridge, Massachusetts, EE.UU.) se llenó con 0,1ml del antígeno de A. fumigatus diluido a 1:2.000 en tampón fostato salino (PBS), pH: 7,2. Después de incubarse durante 18h a 4 oC, se lavó la placa con PBS-TW 20 (Sigma, San Luis, EE.UU.), se añadió a todos los pozos 0,1ml de PBS con un 2% de albúmina bovina (Sigma) y se incubaron a 37 oC durante 1h. A continuación volvió a lavarse la placa en PBS-TW y se añadió a cada pocillo 0,1ml del suero de los pacientes diluido a 1:1.000 en PBS-TW, tras lo cual se incubaron durante 1h a temperatura ambiente. Seguidamente volvieron a lavarse las placas con PBS-TW y se añadió en cada pocillo, para la IgG específica, una anti-IgG humana marcada con peroxidasa diluida a 1:8.000 en PBSTW con un 25% de suero de ternera fetal; para la IgA, una anti-IgA humana a 1:2.000, y para la IgM, una anti-IgM humana a 1:2.000 (Biosource International, Camarillo, California, EE.UU.), y se incubaron durante 1h a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron en PBS-TW y se añadió 0,1ml de sustrato (o-fenilendiamina, 2mg/ml, en agua destilada y un 0,03% de peróxido de hidrógeno) a temperatura ambiente. Después de 15min se paró la reacción en color añadiendo 0,1ml de ácido sulfúrico 4N. Los resultados se expresaron en densidades ópticas (DO) y se midieron a 492nm mediante un espectrofotómetro Titertek-Multiscan (Flow Laboratories, Irvine, Escocia, Gran Bretaña). Todas las pruebas se realizaron por duplicado. Para las IgG, IgA e IgM específicas frente a C. albicans se utilizó el mismo método, con las antiinmunoglobulinas humanas de la casa comercial Sanofi Diagnostic Pasteur (Laboratorio Arístegui, Bilbao, Vizcaya, España). Como grupo control se utilizaron los sueros de 15 individuos sanos, no atópicos ni fumadores. Se consideró que la reacción inmunológica era positiva cuando su valor era mayor que la media más 2 desviaciones estándar del valor de dicha inmunoglobulina en el grupo control (respecto a A. fumigatus: IgG positiva > 0,67 DO; IgA positiva > 0,21 DO; IgM positiva > 0,94 DO. Respecto a C. albicans: IgG positiva > 0,56 DO; IgA positiva > 0,41 DO; IgM positiva > 0,90 DO).

Se utilizó la prueba de la χ2 para comparar entre sí las variables cualitativas. La variable del sistema de puntuación de Brasfield se consideró semicuantitativa y se utilizaron análisis no paramétricos (H de Kruskal-Wallis, prueba de Spearman) cuando se estudió la asociación con otras variables. Si una de las variables se consideraba cuantitativa y la otra cualitativa, se estudió la diferencia de las medias y se comprobó la homogeneidad de las variancias mediante la prueba de Bartlett. Si ambas variables eran cuantitativas, se realizaron correlaciones utilizando el coeficiente de correlación de Pearson. Se llevó a cabo un análisis multivariable para estudiar la posible asociación entre las inmunorrespuestas frente a A. fumigatus y a C. albicans con la edad, el sexo, parámetros espirométricos y sistema de puntuación de Brasfield. El estimador utilizado de la media poblacional fue la media muestral. Para estimar la variabilidad poblacional (variancia, desviación estándar) se empleó la distribución de la t de Student con n-1 grados de libertad. Todos los análisis se realizaron con los programas estadísticos DBase-IV, EpiInfo versión 6.04-b (Borland Internacional, Scotts Valley, California, EE.UU.) y SPSS para Windows versión 8.0 (Chicago, Illinois, EE.UU.).

Las características de los pacientes según la presencia de A. fumigatus y C. albicans se muestran en la tabla II. Respecto a la edad, fue mayor en el grupo de pacientes con A. fumigatus que el grupo de pacientes sin dicho hongo, y no hubo diferencias entre los pacientes con y sin C. albicans. Además, la edad se asoció con un aumento de la probabilidad de cultivar A. fumigatus en las secreciones respiratorias (r = 0,28; p < 0,05), pero no con la probabilidad de cultivar C. albicans (r = 0,10; p = 0,41). No hubo diferencias significativas en los valores de inmunoglobulinas específicas frente a A. fumigatus entre los pacientes con y sin A. fumigatus, ni hubo una correlación significativa entre los valores de inmunoglobulinas específicas y la probabilidad de cultivar A. fumigatus en las secreciones respiratorias.

La probabilidad de cultivar C. albicans en las secreciones respiratorias se asoció con un deterioro respiratorio mayor, aunque sólo alcanzó significación estadística para el sistema de puntuación de Brasfield (r = –0,24; p < 0,05). A diferencia de lo observado para A. fumigatus, las respuestas inmunitarias específicas frente a C. albicans fueron significativamente mayores en los pacientes con C. albicans que en los pacientes sin C. albicans. Además, hubo una correlación significativa entre la probabilidad de cultivar C. albicans en las muestras respiratorias y los valores de inmunoglobulinas específicas (r = 0,63, p < 0,001 para la IgG específica frente a C. albicans; r = 0,61, p < 0,001 para la IgA específica, y r = 0,40, p < 0,05 para la IgM específica).

En la tabla III se muestran las correlaciones entre las concentraciones de IgG, IgA e IgM específicas frente a A. fumigatus y C. albicans, así como las características de los pacientes. No hubo correlación significativa entre el sexo y los valores de IgG, IgA e IgM específicas frente a A. fumigatus. Sin embargo, a diferencia de lo hallado para A. fumigatus, las mujeres sí presentaron concentraciones de IgG, IgA e IgM específicas frente a C. albicans mayores que los varones, con significación estadística para la IgG e IgM (p < 0,05).

Para eliminar posibles factores de confusión se realizó un análisis de regresión lineal múltiple. En este análisis, utilizando el FEV1 como variable dependiente y las IgG, IgA e IgM frente a A. fumigatus, presencia de A. fumigatus en las secreciones respiratorias, edad y sexo como covariables, la edad fue la variable que más contribuyó a un FEV1 menor (beta = –0,21; standar error (SE) = 0,32; p < 0,05). Se observaron resultados similares cuando se utilizó la FVC como variable dependiente (beta = –0,18; SE = 0,42; p < 0,05). Tras un análisis de regresión logística, la edad también fue la principal variable asociada con un Brasfield inferior (beta = –0,14; SE = 0,12; p < 0,05), definido para este análisis como un sistema de puntuación de Brasfield < 18.

Cuando se utilizó el FEV1 como variable dependiente y las inmunorrespuestas frente a C. albicans, presencia de C. albicans en las secreciones respiratorias, edad y sexo como covariables, se objetivó que la edad fue la variable que contribuyó en mayor medida a un FEV1 menor (beta = –0,22; SE = 0,34; p < 0,05). Se observaron resultados similares cuando se utilizó la FVC como variable dependiente. En el análisis de regresión logística la edad también fue la única variable asociada con un sistema de puntuación de Brasfield inferior.