Para este tipo de tejido hay unas recomendaciones elaboradas por los miembros del Banco Europeo de tejido tumoral congelado (TuBaFrost) y ampliamente aceptadas9. En el momento de la obtención el tejido debe recogerse en un recipiente cerrado y mantenerse en frío, sin añadir ningún medio líquido. Debería disponerse de un registro del lapso de tiempo que transcurre entre la escisión u obtención de la muestra y la congelación, ya que, como se verá más adelante, el tiempo transcurrido puede hacer que disminuya la calidad de las muestras.

Por lo que respecta al tipo de congelación, puede realizarse sumergiendo las muestras en nitrógeno líquido (N2L) o bien mediante congelación en isopentano previamente enfriado. La congelación por inmersión en N2L, aunque rápida y fácil, no es la mejor opción, ya que provoca la aparición de crioartefactos que pueden afectar algunas técnicas citológicas. El procedimiento recomendado tanto por la IARC como por el TuBaFrost es la congelación en isopentano7,9. Este procedimiento puede resultar complejo, pues no es sencillo disponer del equipo necesario en el lugar donde van a obtenerse las biopsias y/o muestras. En el caso de que las muestras vayan a utilizarse en histología debe evitarse la congelación lenta del tejido en congelador de −80°C, ya que dificulta mucho la obtención de cortes de criostato de buena calidad debido a la formación de cristales de hielo. El almacenamiento definitivo dependerá de la futura utilización de este tejido.

Un tiempo de isquemia prolongado puede provocar degradación en algunas de las submuestras que se pueden obtener (p. ej., en el ARN)10. Un estudio de Spruessel et al11 demuestra cómo el tiempo de isquemia afecta a los patrones de expresión génica y proteica. Este estudio analizó los cambios que se producen a partir de los 5min de isquemia y hasta los 30min. En este último punto la expresión génica y proteica variaba un 20% respecto a la basal. Por otra parte, el trabajo de Huang et al12, realizado con muestras de cáncer de colon, demuestra que los tiempos de isquemia inferiores a 20min mantienen de forma bastante estable los patrones de expresión génica, mientras que éstos se ven afectados de forma importante a partir de los 40min. Basándose en estos y otros estudios, TuBaFrost recomienda que el tiempo transcurrido entre la escisión y la congelación no supere los 30min. En cualquier caso, siempre que el tiempo sea inferior a las 2h, la muestra se congelará, pero se indicará el tiempo transcurrido entre la escisión y la congelación. Teniendo en cuenta estos resultados y recomendaciones, sería conveniente fijar un tiempo máximo en función del uso final del tejido. Si el tiempo que transcurre es superior al que se estableció en el protocolo, se decidirá si se acepta el tejido, anotando el tiempo transcurrido, o bien si se descarta la muestra.

Si el tejido se va a utilizar para la extracción de ADN, algunos estudios muestran que la estabilidad a −80°C se mantiene a lo largo del tiempo, mientras que la integridad del ARN disminuye a partir de los 5 años de almacenamiento13. Otros autores han descrito que la estabilidad del ADN y del ARN se mantiene durante una década si el tejido ha estado almacenado en vapores de N2L14.

Es una de las muestras habituales en las colecciones porque a partir de ella se pueden obtener varias fracciones y realizar estudios de un amplio espectro de moléculas. Puede cubrir estudios de genómica, proteómica, metabolómica y parámetros hematológicos. Es sencilla y barata de obtener. Los factores que pueden afectar la estabilidad de las muestras son principalmente los anticoagulantes, los estabilizantes, la temperatura, el tiempo entre la extracción y el procesamiento, la esterilidad y los factores endógenos de degradación como el contenido de enzimas15. Es de gran importancia seleccionar los anticoagulantes con los que se va a recoger la sangre, ya que esto condicionará los estudios futuros; por ejemplo, el uso de cualquier anticoagulante induce la producción de citocinas in vitro16. De las muestras de sangre recogidas con citrato de dextrosa se obtienen un ADN y un ARN de buena calidad, y se recupera un número de linfocitos superior para cultivo celular. El uso de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) proporciona buenos resultados en la extracción de ADN, pero da problemas para estudios citogenéticos. Para producir líneas celulares inmortalizadas es necesario recoger la sangre con citrato de dextrosa. Por el contrario, la heparina tiene un efecto adverso sobre la proliferación de linfocitos T y afecta además a la extracción de ADN y a las técnicas de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para estudios de metabolómica el mejor anticoagulante es la heparina de litio.

En algunos estudios epidemiológicos se recoge sangre total únicamente en ácido etilendiaminotetraacético17,18, mientras que en otros se obtienen muestras en diversos anticoagulantes para así disponer de un amplio abanico de posibilidades futuras19.

Otro factor que debe tenerse en cuenta es el tiempo entre la obtención y el procesamiento. El tiempo que transcurre es más o menos crítico en función de los componentes por los que se tenga interés y de su estabilidad. Algunos estudios han analizado la importancia de la etapa preanalítica en los resultados finales20. Para determinados parámetros un período de como mínimo 24h antes del procesamiento y análisis puede dar lugar a variaciones significativas en un 25% de las muestras analizadas21. La viabilidad celular disminuye de forma apreciable a partir de las 48h, aunque algunos estudios, como el de Bull et al22, en que se comparan 2 tiempos de procesamiento distinto (a las 8 y 24h de obtener la muestra), describen una disminución de la viabilidad y una menor secreción de citocinas en las muestras procesadas a partir de las 24h.

Si se quieren obtener células para la extracción de ADN o ARN, será suficiente con realizar un gradiente de centrifugación, a partir del cual se podrá separar el plasma, la fracción leucoplaquetaria y la fracción de eritrocitos. Se prepararán alícuotas de cada una de las fracciones obtenidas y se almacenarán a −80°C.

Si además se requieren células para una posterior inmortalización, hay varios métodos descritos en la bibliografía. Los linfocitos transformados con el virus de Epstein-Barr son una fuente inagotable de ADN. Hay varias posibilidades: por un lado, la extracción y transformación inmediata, y por otro, la extracción, separación celular y criopreservación para una transformación futura. Existe bibliografía que confirma que la criopreservación a largo plazo no afecta de forma significativa a la viabilidad de las células B y tampoco a los índices de transformación23–25.

Las células criopreservadas se almacenarán siempre a −150°C en vapores de N2L26. El transporte de estas muestras se realizará en un contenedor seco de nitrógeno, para evitar que disminuya la viabilidad celular27.

Otra de las fracciones que se pueden obtener a partir de la sangre total es el suero. Es la fracción recomendada para obtener resultados en bioquímica clínica y en estudios metabólicos. Es igualmente importante conservar parte de esta muestra para estudios futuros. En grandes estudios epidemiológicos en los que se analizará un gran número de parámetros en suero se recomienda recoger las muestras de sangre en tubos de plástico siliconados18.

Es otra de las muestras habituales en las colecciones13,15,18, ya que es una muestra sencilla y barata de obtener, que permite realizar estudios de un amplio espectro de moléculas: ADN, proteómica, metabolómica. Es habitual el almacenamiento durante largos períodos de tiempo a −80°C5,18.

A partir de las muestras de esputo, y siguiendo los protocolos de procesamiento de Djukanović et al28, es posible obtener tanto el sobrenadante (que se utilizará para la determinación de factores solubles y de marcadores de inflamación29) como células30. Ambos tipos de productos se almacenarán a −80°C. A partir de los botones celulares congelados del esputo es posible obtener ADN y/o ARN27.

Este tipo de muestra permite determinar de forma no invasiva la inflamación pulmonar31,32. Contiene un amplio número de mediadores, como adenosina, amonio, peróxido de hidrógeno, isoprostanos, leucotrienos, óxido de nitrógeno, péptidos y citocinas. Las sociedades norteamericana y europea de neumología han emitido recomendaciones metodológicas específicas que incluyen la temperatura de almacenamiento33. En algunos estudios, como el de Lehtonen et al34, las muestras se han almacenado a −70°C hasta su utilización futura.

Es el sistema habitual para obtener muestras procedentes del intersticio alveolar (células, microorganismos y sustancias solubles)35. Los primeros 10ml se procesan de forma separada para obtener el lavado bronquial. El resto se deposita en tubos siliconizados y se transporta en hielo al laboratorio, donde se centrifuga a 400g durante 5min y se recuperan las células. Los sobrenadantes se alicuotan y se almacenan a −80°C36. Los botones celulares se congelarán inmediatamente y se almacenarán a −80 o −196°C, según los análisis o estudios que vayan a realizarse en el futuro.

De los broncoaspirados se podrán realizar cultivos microbiológicos diagnósticos y también obtener células para posteriores estudios moleculares. En este último caso las células se almacenaran a −80°C o en N2L en función de los estudios que se vayan a realizar con posterioridad.

Por lo que respecta a las muestras obtenidas mediante punción aspirativa transbronquial, punción aspirativa con aguja fina transtorácica y biopsia aspirativa transtorácica, en todos los casos la muestra que se obtendrá es equivalente a una biopsia de tejido37,38 y, por lo tanto, se seguirán las recomendaciones descritas en el apartado “Biopsias de tejidos sólidos”.

En el caso de los cultivos celulares, las muestras se criopreservarán y almacenarán en N2L. En el caso de los bloques y de las células en botones celulares, se congelarán rápidamente y se almacenarán a −80°C o en N2L en función de su utilización futura.

En la tabla 2 se han resumido las recomendaciones de diferentes organismos internacionales sobre las temperaturas de conservación a largo plazo.

La obtención de diversos productos a partir de las muestras iniciales (células, tejidos, sangre u orina) será el objetivo final de muchos de los estudios de proteómica y genómica. En la bibliografía científica y entre los grupos de trabajo de organismos internacionales no hay unas recomendaciones comunes para el almacenamiento del ADN, ARN y proteínas. En la bibliografía científica sí se describe mayoritariamente el almacenamiento del ARN a −70°C39 o −80°C40.

En el caso del ADN la variabilidad es mayor y las recomendaciones de temperatura están en función del período previsto de almacenamiento. En la tabla 3 se detallan algunas de las recomendaciones de diversos estudios respecto al almacenamiento del ADN, que varía entre +4°C y −80°C. En la tabla se recogen las temperaturas de almacenamiento que los principales proyectos sobre genómica de poblaciones están utilizando en la actualidad. Algunos de estos proyectos almacenan diferentes alícuotas de ADN a diferentes temperaturas. Un ejemplo de esto sería el Banco Nacional de ADN de Salamanca, que para un almacenamiento inferior a 2 meses recomienda +4°C; para un almacenamiento a corto plazo (hasta un año), −20°C, y para períodos superiores al año, −80°C.

También existe la posibilidad de almacenar gotas de sangre o de otros fluidos sobre papel FTA (papel de filtro tratado) a temperatura ambiente para la posterior extracción de ADN. El estudio de Burger et al41 demuestra que es posible obtener ADN de muestras de saliva almacenada en papel FTA mantenido a temperatura ambiente durante 2 años, aunque en otro estudio similar Sigurdson et al42 no consiguen obtener ADN de calidad con el mismo tipo de muestras almacenadas durante 7 años a temperatura ambiente. Rajendram et al43, que realizaron un estudio con suspensiones bacterianas, concluyen que es posible obtener ADN de buena calidad de estas muestras después de 3 años de almacenamiento a temperatura ambiente. Por último, Galaal et al44, que almacenaron a temperatura ambiente células tumorales de ovario sobre papel FTA, obtuvieron ADN de buena calidad al cabo de 5 años y ARN después de 6 meses de almacenamiento.

Son varios los estudios que han analizado la estabilidad de diversas proteínas y metabolitos después de largos períodos de almacenamiento. Algunos concluyen que no hay variaciones en las concentraciones de diversas proteínas séricas cuando han estado almacenadas a −70°C45,46. En cambio otros, como el de Basit et al47, concluyen que un almacenamiento a −70°C durante más de 2 años sí puede afectar a las concentraciones séricas de determinadas proteínas. Shih et al48 describen asimismo un efecto sobre los valores de lípidos y lipoproteínas en suero como consecuencia del tiempo de almacenamiento a −70°C.

Se utilizará el sistema triple de embalaje, incluso para el transporte local por carretera, y se seguirán las instrucciones de embalaje 650 (PI650) de la Organización de las Naciones Unidas, que se resumen a continuación. En general, para este grupo, los embalajes deben ser de buena calidad a fin de evitar posibles incidentes, y constarán de un sistema triple (un recipiente primario, un embalaje/envase secundario y un embalaje/envase exterior). Además, el envase primario se envolverá con un material absorbente por si hubiera un derrame accidental. El embalaje exterior se identificará con el símbolo correspondiente y con la designación oficial de transporte: «Sustancia biológica de categoría B». (Hay algunas especificaciones exclusivas para el transporte aéreo50 que no se detallan aquí.) En la figura 2 se muestra el embalaje correspondiente al UN 3373.

Figura 2.

Esquema de embalajes UN 3373. (Esquema obtenido de la Guía sobre la reglamentación relativa al transporte de sustancias infecciosas, 2007–200849, de la Organización Mundial de la Salud.)

(0.18MB).

Se utilizará el sistema triple de embalaje, incluso para el transporte local por carretera. Las sustancias infecciosas de la categoría A sólo pueden transportarse en embalajes/envases que cumplan las especificaciones correspondientes a la clase 6.2 de Naciones Unidas y la instrucción de embalaje 602 (PI602), que son las mismas que las definidas para el grupo UN 3373. Además, estas muestras cumplirán el siguiente requisito: los embalajes/envases interiores que contengan sustancias infecciosas no se agruparán con embalajes/envases interiores que contengan mercancías que no sean afines.

Por otra parte, las sustancias infecciosas incluidas en el número UN 2814 se embalarán/envasarán con arreglo a las siguientes disposiciones:

• 1.

  Sustancias expedidas a temperatura ambiente o superior: los recipientes primarios serán de vidrio, de metal o de plástico. Para asegurar la estanqueidad se utilizarán termosoldaduras, tapones de faldón o cápsulas metálicas encastadas. Si se emplean tapones roscados, se reforzarán con bandas, cinta adhesiva o cierres de fijación fabricados para tal fin.

• 2.

  Sustancias expedidas refrigeradas o congeladas: el hielo, el hielo seco u otro producto refrigerante se colocará alrededor del envase secundario o bien en el interior de un sobreembalaje que contenga uno o varios bultos completos marcados según lo prescrito. Se colocarán calzos interiores para que el embalaje secundario se mantenga en su posición inicial cuando el hielo o el hielo seco se hayan fundido o evaporado. Si el refrigerante es hielo, el embalaje exterior o el sobreembalaje habrán de ser estancos. Si el refrigerante es hielo seco, el embalaje exterior o el sobreembalaje habrán de permitir la salida del gas carbónico. El recipiente primario y el embalaje/envase secundario conservarán su integridad a la temperatura del refrigerante utilizado.

• 3.

  Sustancias expedidas en N2L: se utilizarán recipientes primarios de plástico capaces de soportar temperaturas muy bajas. El embalaje/envase secundario también habrá de poder soportar temperaturas muy bajas y, en la mayoría de los casos, tendrá que ajustarse sobre el recipiente primario individualmente. Se aplicarán asimismo las disposiciones relativas al transporte de N2L. El recipiente primario y el embalaje/envase secundario conservarán su integridad a la temperatura del N2L.

• 4.

  Las sustancias liofilizadas también podrán transportarse en recipientes primarios consistentes en ampollas de vidrio termoselladas o frascos de vidrio con tapón de caucho y precinto metálico.

Sea cual fuere la temperatura prevista para la sustancia durante el transporte, el recipiente primario o el embalaje/envase secundario habrán de poder resistir, sin que se produzcan fugas, una presión interna que produzca una diferencia de presión de no menos de 95 kPa y temperaturas de −40 a +55°C.

En la figura 3 se detalla el embalaje correspondiente al UN 2814.

Figura 3.

Esquema de embalaje UN 2814. (Esquema obtenido de la Guía sobre la reglamentación relativa al transporte de sustancias infecciosas, 2007–200849, de la Organización Mundial de la Salud.)

(0.17MB).